來源：測序中國        時間：2020-03-15

       基于牛津納米孔GridION平臺完成新冠病毒RNA直接測序，單條Read即可覆蓋大部分病毒序列 新冠病毒肺炎疫情暴發(fā)以來，病毒基因組分析在公共衛(wèi)生響應(yīng)中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，病毒序列信息的快速共享也推動了相關(guān)基因組流行病學(xué)研究，為全球早日遏制病毒傳播并完全攻克病毒提供了助力?；诠_共享的序列數(shù)據(jù)，現(xiàn)有研究表明新冠病毒在遺傳學(xué)上的基因表達(dá)機(jī)制和分子進(jìn)化速率可能與此前表征的冠狀病毒相當(dāng)。利用新冠病毒特異性數(shù)據(jù)對這些假設(shè)進(jìn)行實驗驗證，將有可能進(jìn)一步揭示這種新型病原體的生物學(xué)特性。 

       近日，預(yù)印本網(wǎng)站bioRxiv發(fā)布了澳大利亞墨爾本大學(xué)微生物和免疫學(xué)系Lachlan Coin和Sebastian Duchene團(tuán)隊及合作者的最新研究成果。研究團(tuán)隊報告了新冠病毒的第一個直接RNA序列，詳細(xì)介紹了該冠狀病毒亞基因組長度的mRNA結(jié)構(gòu)，并基于共享數(shù)據(jù)揭示了新冠病毒進(jìn)化遺傳學(xué)的各個方面。 

       研究團(tuán)隊介紹，新冠病毒是一種冠狀病毒科陽性單鏈RNA病毒，已知的冠狀病毒通過一種負(fù)鏈不連續(xù)延伸的機(jī)制，產(chǎn)生多聚腺苷酸化的亞基因組長度的mRNA轉(zhuǎn)錄物嵌套集。這種機(jī)制能夠產(chǎn)生不同長度的mRNA轉(zhuǎn)錄物，而用于RNA病毒的標(biāo)準(zhǔn)測序技術(shù)無法產(chǎn)生代表RNA病毒基因組或亞基因組長度的mRNA的reads，因為它們產(chǎn)生的reads長度較短，并且依賴于擴(kuò)增以產(chǎn)生互補(bǔ)的DNA（cDNA）序列。  

      為了確定冠狀病毒亞基因組長度的mRNA結(jié)構(gòu)，研究人員使用了一種基于高度平行納米孔陣列的RNA直接測序技術(shù)：從具有高水平新冠病毒培養(yǎng)材料中獲取并制備核酸，并利用Oxford Nanopore Technologies公司的GridION平臺上使用poly（T）接頭和R9.4 flowcell進(jìn)行了測序。  

       據(jù)悉，在40小時的測序過程中，病毒樣品共產(chǎn)生了680,347個reads，包含了860Mb的序列信息。研究人員與培養(yǎng)的新冠病毒分離株（MT007544.1）基因組進(jìn)行比對后發(fā)現(xiàn)，其中一部分reads屬于冠狀病毒序列（28.9％），共367Mb，分布在整個病毒基因組（29,893 bp）中。此外，許多reads長度大于20kb，單個分子測序數(shù)據(jù)就捕獲了大部分新冠病毒基因組?？偠灾琑NA直接測序提供了平均12230倍的新冠病毒基因組的覆蓋范圍，偏向聚腺苷酸3 '尾近端序列，這種偏向性反映了攜帶這些序列的亞基因組長度mRNA的豐度較高。 

 圖：SARS-CoV-2遺傳學(xué)和亞基因組長度的mRNA結(jié)構(gòu)

       研究人員表示，除了5 '帽結(jié)構(gòu)的甲基化和3 '聚腺苷酸的高效翻譯所需的病毒編碼序列，其他RNA修飾也可能在新冠病毒中發(fā)揮功能作用。通過對RNA直接序列數(shù)據(jù)分析，研究人員還確定了42個具有可預(yù)測的5-甲基胞嘧啶修飾的位點，這些位點在亞基因組長度的mRNA之間呈現(xiàn)一致的位置。在其他陽性單鏈病毒中，RNA甲基化在感染過程中會發(fā)生動態(tài)變化，影響宿主與病原體之間的相互作用和病毒復(fù)制。  

      此外，除了研究新冠病毒遺傳學(xué)的假定特征，研究人員還基于序列數(shù)據(jù)估算了其分子進(jìn)化速率。研究人員精選了一組高質(zhì)量的公共新冠病毒基因組序列進(jìn)行了貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示與流行病學(xué)證據(jù)和其他近期分析結(jié)果一致。 總而言之，通過使用RNA直接測序數(shù)據(jù)，該研究進(jìn)一步揭示了新冠病毒的分子生物學(xué)信息，為更詳細(xì)了解病毒亞基因組長度mRNA的結(jié)構(gòu)提供了寶貴信息。