文章來源：生物通       時(shí)間：2021-02-18

       編輯推薦： 　　

       本次推送為大家獻(xiàn)上一份ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)用戶可以參考的《單細(xì)胞長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序建庫(kù)方案》。 

       在有些研究場(chǎng)景下，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序（long-read sequencing）方法相比傳統(tǒng)的短讀長(zhǎng)測(cè)序（short-read sequencing）方法，會(huì)是一個(gè)更好的選擇。長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建操作相對(duì)簡(jiǎn)便。需要多次重復(fù)構(gòu)建文庫(kù)時(shí)，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序也不需面對(duì)短讀長(zhǎng)測(cè)序那樣復(fù)雜繁瑣的操作流程。此外，長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序建庫(kù)過程中，轉(zhuǎn)錄本cDNA不會(huì)被打斷，測(cè)序數(shù)據(jù)分析時(shí)無需reads拼接步驟，直接檢測(cè)轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)信息。因此，對(duì)于一些融合事件、異構(gòu)體，以及其它結(jié)構(gòu)變異的檢測(cè)能力得到提升。 

       本次推送為大家獻(xiàn)上一份ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)用戶可以參考的《單細(xì)胞長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序建庫(kù)方案》。 

       基于ICELL8 cx系統(tǒng)的SMART-Seq應(yīng)用工作流程，將和Oxford Nanopore Technology（ONT）一起奉獻(xiàn)一場(chǎng)精彩的表演。  

      在該建庫(kù)方案中，以單細(xì)胞起始，通過ICELL8 3'DE引物和5' SMART引物來合成cDNA及擴(kuò)增。反轉(zhuǎn)錄酶首先以O(shè)ligo d(T)為引物，mRNA為模板，合成cDNA。合成進(jìn)行至mRNA模板5’末端時(shí)，5’SMART引物會(huì)作為新的模板，讓反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行。這樣就可以獲得兩端帶有接頭的轉(zhuǎn)錄本全長(zhǎng)cDNA。熟悉SMART技術(shù)的您已經(jīng)知道了，這是一個(gè)模板轉(zhuǎn)換的過程。獲得單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄本的全長(zhǎng)cDNA后，由ICELL8 3'DE引物對(duì)cDNA進(jìn)行擴(kuò)增。以上過程通過一個(gè)RT-PCR步驟直接完成。 

      cDNA擴(kuò)增任務(wù)完成后，開始接頭序列的連接。首先，通過一次PCR將ONT接頭連接到cDNA產(chǎn)物的兩端。然后，由第二次PCR將修飾的ONT Whole Genome Primer（WGP)連接到的cDNA產(chǎn)物上。最后，加入Rapid Adapter進(jìn)行連接，即完成建庫(kù)流程。 

       連接好接頭后，即可在ONT測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。完整的流程示意圖送給大家。 

        建庫(kù)流程可看成兩個(gè)部分： 

        01 

       單細(xì)胞分選，合成cDNA，并連接ONT接頭。  

       ICELL8 cx系統(tǒng)利用微泵微閥裝置，配合微孔芯片完成單細(xì)胞的分選，通過熒光成像系統(tǒng)記錄下獲得單個(gè)細(xì)胞微孔的位置信息，并在微孔芯片中進(jìn)一步完成單細(xì)胞cDNA的合成與擴(kuò)增。 

       芯片微孔中已預(yù)先固相化了連接有條碼標(biāo)簽序列的Oligo d(T)引物，來自同一個(gè)單細(xì)胞的mRNA合成cDNA后將連接上相同的條碼標(biāo)簽。 

        我們用K562細(xì)胞進(jìn)行了一個(gè)測(cè)試，看看這一部分結(jié)束后收獲的cDNA文庫(kù)情況如何： 

       02 

       cDNA產(chǎn)物連接ONT Whole Genome Primer。 

        在這一步，取01中獲得cDNA產(chǎn)物 2ng，加入到反應(yīng)試劑中，進(jìn)行一步PCR反應(yīng)。

        我們?cè)倏匆豢刺砑雍肙NT WGP之后，測(cè)序文庫(kù)的情況如何： 

        上機(jī)測(cè)序前，還需要經(jīng)過簡(jiǎn)單的操作，連接好Rapid Adapter。 

        以上就是ICELL8 cx單細(xì)胞分選系統(tǒng)與ONT聯(lián)袂奉獻(xiàn)的精彩建庫(kù)表演。 

        但是…我們的方案還沒結(jié)束！ 單細(xì)胞測(cè)序怎么少得了…數(shù)據(jù)處理！ 

       一套ICELL8-ONT分析流程專門用于分析該文庫(kù)的下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)。該分析流程由5個(gè)分析腳本（script）組成 ，完成對(duì)原始FASTQ文件的處理。得到的結(jié)果可以用于下游的各種數(shù)據(jù)可視化分析。