2017年4月，CLSI發(fā)布了第一版的使用MALDI-TOF MS方法鑒定微生物的指導(dǎo)方針CLSI M58，CLSI作為臨床微生物業(yè)界最權(quán)威的標準化機構(gòu)，對MALDI-TOF MS這一新的微生物鑒定方法做出的指導(dǎo)性文件有著里程碑一般的意義，一方面，標志著質(zhì)譜技術(shù)用于微生物常規(guī)鑒定已經(jīng)成為業(yè)界普遍認可的一種主流方法，另一方面，該文件的發(fā)布，也標志著這一新技術(shù)的應(yīng)用也開始走上了標準化的道路。

       標準的摘要部分對該文件的范圍做了概述，CLSI M58文件針對在醫(yī)學實驗室中使用MALDI-TOF MS的用戶提供指導(dǎo)，包括對分析前樣本的準備、分析過程、結(jié)果的判讀、報告、問題處理以及質(zhì)量體系的建立等，小編計劃按這三部分內(nèi)容分期和大家一起學習，希望對微生物工作者能有所幫助。

       首先該文件對其指導(dǎo)范圍以及MALDI-TOF MS的技術(shù)原理做了描述，值得注意的是，該指導(dǎo)方針僅針對MALDI-TOF MS用于臨床細菌鑒定而不包括其他研究的應(yīng)用，像樣本培養(yǎng)前的直接鑒定，以及使用MALDI-TOF MS進行藥物敏感性試驗都不在描述范圍內(nèi)。

       “雖然有限的研究顯示MALDI-TOF MS在某些情況下適用于該目的（AST），但它在診斷實驗室的應(yīng)用前景仍然不明確，該方法仍有待進一步開發(fā)”

       MALDI-TOF MS作為一種蛋白指紋圖譜識別技術(shù)，并非對特定的蛋白進行識別，而是對單個微生物的總體蛋白構(gòu)成進行分析。一般來說，在一個微生物蛋白圖譜中雖然高強度的特征蛋白峰數(shù)量較少，而實際納入分析的質(zhì)量峰數(shù)一般會有100~200個，并和數(shù)據(jù)庫中的圖譜進行對比，不同系統(tǒng)間進行圖譜對比的算法雖然各有不同，但商業(yè)化數(shù)據(jù)庫和算法的建立，對于提供診斷級的報告是至關(guān)重要的。在對性能特性的描述中，文件首先肯定了MALDI-TOF MS比傳統(tǒng)生化表型的鑒定方法更為可靠，接著也提出，數(shù)據(jù)庫仍然是影響其性能表現(xiàn)的關(guān)鍵因素。

       “當使用基因測序作為參考方法時，MALDI-TOF MS相比傳統(tǒng)的生化表型鑒定方法有更好的表現(xiàn)，而不同系統(tǒng)間在性能上可能表現(xiàn)出不同程度的差異，而這種差異歸因于系統(tǒng)的圖譜數(shù)據(jù)庫的不同，而隨著技術(shù)發(fā)展，數(shù)據(jù)庫也會不斷擴展、完善”

       “某些情況下，該方法不能提供一個高可信度的結(jié)果，一些特定的近緣種之間通過MALDI-TOF也不能區(qū)分，這時候需要一些補充試驗來獲得決定性的鑒定結(jié)果。這些局限性隨著數(shù)據(jù)庫的不斷擴展和計算方法的改善可能得到解決”

第一部分 分析前的樣本準備和分析過程

培 養(yǎng)

       培養(yǎng)是鑒定前關(guān)鍵的一步，合格的培養(yǎng)是獲得可靠鑒定結(jié)果的基礎(chǔ)。首先對于選擇的分離株，必須保證細菌純度以及足夠的菌量，而培養(yǎng)條件對于鑒定結(jié)果并不會有太大影響，因為培養(yǎng)條件的不同不大會影響相關(guān)分析蛋白的表達。然而也有一些例外，如

       1、當使用液體培養(yǎng)基時需考慮菌的純度，建議傳代培養(yǎng)確認是否純培養(yǎng)

       2、在使用選擇性培養(yǎng)基時，可能會對圖譜的質(zhì)量有影響，建議轉(zhuǎn)種非選擇性平板后再分析

       3、培養(yǎng)時間應(yīng)遵守廠家推薦的范圍（一般18-24小時），超過72小時的波峰強度和圖譜質(zhì)量會下降，而對于為了快速報告而在短時間培養(yǎng)后即使用MALDI-TOF MS鑒定的情況下，之后應(yīng)確認培養(yǎng)的純度

       檢測樣本的制備

       在分離株的樣本準備階段，對于大部分的細菌而言，是可以通過直接涂靶板或者板上提取的方法來完成的，而某些具有復(fù)雜細胞壁成分的微生物，如分枝桿菌、絲狀真菌等則需要更嚴格的提取方法來釋放胞內(nèi)蛋白。除此之外，對于有高度生物危害的微生物則必須分析前進行滅活，包括布魯氏菌、鼠疫耶爾森菌、結(jié)核分枝桿菌、雙相真菌等等。

       這部分內(nèi)容詳細介紹了樣本的涂板方式包括直接涂板和必要的提取步驟，而提取方法分為了板上提取和試管提取兩種，板上提取的方法顧名思義，就是在將細菌涂在靶板上后通過有機溶液的覆蓋接觸來完成，比如對于一般的酵母菌而言就可以使用這種方法而沒有必要采取試管提取，該方法操作簡單快速且成本低廉，但對于分枝桿菌、絲狀真菌以及某些有生物危害的微生物則必須進行完整的試管提取方法，保證生物安全和提取效果；試管提取則是一種更充分的提取方法，但相對操作也更加繁瑣。在涂靶板的環(huán)節(jié)，如何涂一個高質(zhì)量的靶點，也是十分講究的并且需要反復(fù)練習，需要做到涂布均勻且涂層厚薄適中。如下圖中所看到的，A1，A2的靶點涂得太薄，B1，B2則太厚 ，而C1，C2則涂到了靶孔外，可能引起交叉污染，也是不可取的，最優(yōu)的涂布應(yīng)如A3，A4那樣。

特殊細菌的處理方法

       對于黏液狀菌落，由于細胞外的莢膜蛋白成分可能干擾到對胞內(nèi)蛋白的分析而導(dǎo)致鑒定失敗，這里也給出了一些建議的處理方法，如用棉簽撥去菌落表面的黏液成分，再進行挑取。

       在涂板時，對于經(jīng)驗不夠豐富的操作人員可以選擇同一樣本涂布2~3個靶孔，防止由于單個靶孔涂布失敗導(dǎo)致沒有鑒定結(jié)果。在處理某些難以涂布的菌落時，可以先將菌落混合懸浮于基質(zhì)液中，再使用懸浮也進行涂板。

       對于抗酸桿菌而言，目前最有效的滅活提取方法還是在乙醇溶液中使用硅珠進行機械破壁，但該過程必須在生物安全達到2級以上的實驗室（BSL-2）進行。目前已經(jīng)有商業(yè)化的數(shù)據(jù)庫能夠進行這些菌的鑒定，但需要注意的是，當在商業(yè)數(shù)據(jù)庫下進行鑒定時應(yīng)采用和建庫時相同的提取方法，同理，在自建數(shù)據(jù)庫的情況下也要保證建庫和鑒定時使用相同的提取方法。 而對于絲狀真菌，目前有很多種提取方法，雖然大部分都相對簡單，但實驗室仍然需要注意這類細菌的一些特殊之處，除了在細胞壁成分上和普通細菌有差別，還有其特殊的生殖結(jié)構(gòu)，如瓶梗、分生孢子等，因此培養(yǎng)時間的長短將引起蛋白圖譜的顯著不同，包括在挑取菌落時的選擇也會有很大影響，因此操作時必須要遵守各個廠家的特定指導(dǎo)，包括：檢測前的培養(yǎng)時間、挑選菌落的部分、使用的工具和滅活提取的流程。

陽性血培養(yǎng)樣本的直接鑒定

       陽性血培養(yǎng)的直接鑒定目前是被討論比較多的話題，盡管該方法大幅縮短了報告時間并幫助臨床實現(xiàn)了早期的最優(yōu)抗感染治療，但CLSI仍然認為該方法仍有其固有的局限性，而且目前市面上的MALDI-TOF MS產(chǎn)品在該項應(yīng)用上并沒有獲得相關(guān)的法規(guī)認可，因此使用者必須對該方法獲得的結(jié)果進行進一步的驗證，或在進行該方法的同時，平行進行傳統(tǒng)的方法（傳代培養(yǎng)后鑒定）以進行驗證。該方法的一個主要局限性在于無法鑒定多重感染的樣本，當然如果通過革蘭染色發(fā)現(xiàn)有多種病原菌的話就不能再使用該方法，而應(yīng)傳代分純之后再鑒定。在進行MALDI-TOF MS分析之前，陽性的血培養(yǎng)首先應(yīng)去除血液和培養(yǎng)基中的干擾蛋白，并富集細菌以保證足夠的生物蛋白，目前常用的一些方法包括離心或者過濾來富集細菌，并通過清洗來進行純化，使用一些溶血性的成分來破壞完整的紅細胞。

       以上內(nèi)容包含了CLSI M58文件對于MALDI-TOF MS分析前和分析中的內(nèi)容闡述，在下一期內(nèi)容將和大家分享對于MALDI-TOF MS提供的鑒定結(jié)果如何解讀并進行報告，以及一些常見的問題處理，歡迎持續(xù)關(guān)注我們的更新內(nèi)容。

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