原創(chuàng) 2017-08-15 小胡 臨床檢驗醫(yī)學(xué)

        前言

       許多微生物實驗室，日常工作結(jié)束后，就把原始標本和平板高壓滅菌處理掉了。對于菌株的保存并不太重視，保存臨床陽性標本，對于臨床教學(xué)、科研非常重要且十分必要。下面就針對如何保存菌株，和大家分享幾種常用方法。

       微生物具有容易變異的特性，因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。

       低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據(jù)這三個因素而設(shè)計的。

      低溫冰箱  保藏方法大致可分為以下幾種： 

       1．傳代培養(yǎng)保藏法   

       又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、皰肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細菌用），培養(yǎng)后于4—6℃冰箱內(nèi)保存。   

       2．液體石蠟覆蓋保藏法   

       是傳代培養(yǎng)的變相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，以減弱代謝作用。   

       3．載體保藏法   

       是將微生物吸附在適當?shù)妮d體，如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙保藏法應(yīng)用相當廣泛。  

        4．寄主保藏法   

       用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其他方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。   

       5．冷凍保藏法   

       可分低溫冰箱（-20~-30℃，-50~-80℃）、干冰酒精快速凍結(jié)（約-70℃）和液氮（-196℃）等保藏法。   

       6．冷凍干燥保藏法   

       先使微生物在極低溫度（-70℃左右）下快速冷凍，然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。

       雙人雙鎖 管理 其中最常用的是下面的幾種保存方法

       一、石蠟油低溫保藏法

       本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長和代謝停止狀態(tài)，同時石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在-4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。

       具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右)干熱處理，去除滅菌時滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm為宜。

       二、甘油管冷凍保藏法   

       本法也是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(10的8次方～10的10次方/ml)。

       取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為10%-30%，于-70℃下凍存。-20℃保存時間較短?；虿捎皿w積比為8：2的甘油－生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至-20℃冰箱保存。

       該法適用于一般細菌的保存，同時也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。

       甘油－生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營養(yǎng)成分，從而更好地保護了待保存的菌株。

       該法適用于一般細菌的保存，同時也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油－生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營養(yǎng)成分，從而更好地保護了待保存的菌株。

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        三、 冷凍干燥保藏法

       冷凍干燥法是國內(nèi)外一致認為比較理想的菌種保藏方法。冷凍真空干燥保藏法又稱冷凍干燥保藏法，簡稱凍干法。它通常是用保護劑制備擬保藏菌種的細胞懸液或孢子懸液于安瓿管中，再在低溫下快速將含菌樣凍結(jié)，并減壓抽真空，使水升華將樣品脫水干燥，形成完全干燥的固體菌塊。并在真空條件下立即融封，造成無氧真空環(huán)境，最后置于低溫下，使微生物處于休眠狀態(tài)，而得以長期保藏。常用的保護劑有脫脂牛奶、血清、淀粉、葡聚糖等高分子物質(zhì)。

       由于此法同時具備低溫、干燥、缺氧的菌種保藏條件，因此保藏期長，一般達5～15年，存活率高，變異率低，是目前被廣泛采用的一種較理想的保藏方法。除不產(chǎn)孢子的絲狀真菌不宜用此法外，其他大多數(shù)微生物如病毒、細菌、放線菌、酵母菌、絲狀真菌等均可采用這種保藏方法。 保藏菌種需用時，可在無菌環(huán)境下開啟安瓿管，將無菌的培養(yǎng)基注入安瓿管中，固體菌塊溶解后，搖勻復(fù)水，然后將其接種于適宜該菌種生長的斜面上適溫培養(yǎng)即可。該法操作比較煩瑣，技術(shù)要求較高，且需要凍干機等設(shè)備。