2018-04-28   10:15       文章來(lái)源： 檢驗(yàn)視界網(wǎng)

       前言

       從目前的情況來(lái)看，大多數(shù)的微生物實(shí)驗(yàn)室采用的是一些傳統(tǒng)的細(xì)菌鑒定手段，如革蘭氏染色、氧化酶等生化反應(yīng)，或者是采用梅里埃公司的API和Vitek鑒定系統(tǒng)。這些檢測(cè)手段都很浪費(fèi)時(shí)間，通常需要六到八個(gè)小時(shí)，對(duì)于一些難培養(yǎng)的細(xì)菌鑒定來(lái)說(shuō)，將會(huì)耗費(fèi)更多的時(shí)間。有時(shí)候我們也會(huì)采用一些分子生物學(xué)上的手段，來(lái)展開(kāi)鑒定，如對(duì)16SrDNA展開(kāi)分析。不過(guò)16SrDNA對(duì)于生長(zhǎng)慢和難培養(yǎng)的細(xì)菌鑒定起來(lái)比較困難，對(duì)于實(shí)驗(yàn)人員的素質(zhì)要求和經(jīng)驗(yàn)比較高，價(jià)格也是昂貴的。MALDI-TOF MS的出現(xiàn)，或許將改變這種現(xiàn)有的診斷模式，其方法簡(jiǎn)便、快速以及可靠的優(yōu)點(diǎn)必將得到普遍認(rèn)同。這項(xiàng)技術(shù)將會(huì)將細(xì)菌的鑒定時(shí)間由以小時(shí)計(jì)算推進(jìn)到以分鐘計(jì)算，聽(tīng)起來(lái)就令人感到興奮。

       MALDI-TOF MS（Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry）即基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜作為一種新型的軟電離生物質(zhì)譜技術(shù)，被越來(lái)越多的應(yīng)用于生命科學(xué)等領(lǐng)域的多個(gè)學(xué)科，不僅具有靈敏度高、準(zhǔn)確度高且易于自動(dòng)化等優(yōu)勢(shì)，而且較之傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，MALDI-TOF MS檢測(cè)的快速、對(duì)急性病例或特殊病原菌的準(zhǔn)確檢測(cè)及其在耐藥方面的應(yīng)用使其擁有更好的發(fā)展前景。 應(yīng)用傳統(tǒng)的化學(xué)方法對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，仍然是現(xiàn)在大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室所采取的鑒定方法，但是對(duì)于一些難鑒定菌及培養(yǎng)要求苛刻的病原體，常規(guī)鑒定方法并不能滿足實(shí)驗(yàn)室及臨床的應(yīng)用。然而，MALDI-TOF MS技術(shù)不僅能夠快速鑒定，而且也為微需氧菌、厭氧菌、真菌、結(jié)核分枝桿菌及病毒等難鑒定、難培養(yǎng)病原體的鑒定彌補(bǔ)了生化鑒定方面的不足。目前，MALDITOF MS在食源性監(jiān)測(cè)及科研等中的應(yīng)用日益增多，也被臨床實(shí)驗(yàn)室逐漸所采納。

       MALDI-TOF MS的基本原理

       1、 MALDI-TOF MS的組成

       儀器主要由兩部分組成：基質(zhì)輔助激光解吸電離離子源（MALDI）、飛行時(shí)間質(zhì)量分析器（TOF）。

       2、 MALDI-TOF MS的工作原理

       基于不同的微生物具有不同的蛋白質(zhì)譜圖，而MALDI-TOF MS可電離相對(duì)分子質(zhì)量為100~1000000的生物分子，電離后不同的離子又具有不同的質(zhì)荷比，質(zhì)譜也能找出種間和株間特異保守峰作為生物標(biāo)記從而將其區(qū)分開(kāi)，所以MALDI的具體原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì)子，從而使生物分子電離，適用于混合物及生物大分子的測(cè)定。而TOF的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)飛行管道，根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同而被檢測(cè)，即測(cè)定離子的質(zhì)荷比（M/Z）與離子的飛行時(shí)間成正比檢測(cè)離子。根據(jù)檢測(cè)的結(jié)果與數(shù)據(jù)庫(kù)中的參考圖譜進(jìn)行比對(duì)，從而得到結(jié)果。

       MALDI-TOF MS的常規(guī)應(yīng)用

       1、MALDI-TOF MS對(duì)常見(jiàn)細(xì)菌的鑒定

       對(duì)于臨床中的不同標(biāo)本如鼻咽分泌物、咽拭子、腦脊液、胸腹水、肛拭子及尿液等進(jìn)行微生物培養(yǎng)后，將其菌落進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，據(jù)統(tǒng)計(jì)MALDI-TOF MS能準(zhǔn)確鑒定大部分革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌如葡萄球菌屬、鏈球菌屬、放線菌屬、奴卡菌屬、棒狀桿菌屬、紅球菌屬、腸桿菌科細(xì)菌、變形桿菌、流感嗜血桿菌、副流感嗜血桿菌、卡他莫拉菌、不動(dòng)桿菌屬、耶爾森菌屬等。

       張明新等復(fù)蘇560株臨床分離株，應(yīng)用MALDI-TOF MS鑒定臨床常見(jiàn)病原菌。MALDI-TOF MS與Vitek2Compact鑒定結(jié)果比較，G+細(xì)菌鑒定符合率為94.6％（246／260），G-細(xì)菌鑒定符合率為96.7％（174／180），酵母菌鑒定符合率為95.0％（57／60），腸道致病菌鑒定符合率為93.3％（56／60）。15株鑒定結(jié)果不符的菌株經(jīng)16SrDNA測(cè)序確認(rèn)，結(jié)果與Vitek-Compact和MALDI-TOF MS鑒定符合率分別為26.7％（4／15）和66.7％（10／15）。Sogawa K等將從臨床實(shí)驗(yàn)室獲得的468株菌落直接點(diǎn)靶進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定，物種和屬各級(jí)的識(shí)別率分別為91.7%（429/468）和97.0%（454/468）。

       由于不動(dòng)桿菌屬需要不同的治療措施，所以對(duì)其的快速且準(zhǔn)確的診斷是十分重要的。Kishii K等應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)分離自血液中的123例不動(dòng)桿菌屬標(biāo)本的研究顯示：能夠確認(rèn)到種的有106/123（86.2%），而16/123（13.0%）只能鑒定到不動(dòng)桿菌屬。并對(duì)106株標(biāo)本進(jìn)行了基因序列測(cè)定，其中89/106（84.0%）與MALDI-TOF MS的鑒定是一致的。研究還顯示這123株屬于13種不動(dòng)桿菌屬，而且皮氏不動(dòng)桿菌的感染率超過(guò)了鮑曼不動(dòng)桿菌達(dá)到42/12 3（34.1%）。

       2、MALDI-TOF MS對(duì)微需氧及厭氧菌的鑒定

       近年來(lái)隨著臨床對(duì)微需氧及厭氧菌的日益重視，對(duì)其的檢測(cè)研究逐漸增多，其培養(yǎng)陽(yáng)性率也逐漸提高。但微需氧及厭氧菌對(duì)培養(yǎng)條件及鑒定條件要求苛刻，傳統(tǒng)生化鑒定技術(shù)很難滿足臨床實(shí)驗(yàn)室快速準(zhǔn)確鑒定微需氧及厭氧菌的要求。對(duì)于空腸彎曲菌等微需氧菌的鑒定目前仍缺乏統(tǒng)一的鑒定方法，利用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)其進(jìn)行鑒定漏診率及所需時(shí)間都大大降低，既滿足了臨床對(duì)確診的需要，也滿足了臨床快速鑒定的要求。

       袁梁等人利用MALDI-TOF MS技術(shù)對(duì)56株厭氧菌進(jìn)行了研究顯示：53株MALDI-TOF MS與16SrRNA基因序列鑒定結(jié)果一致，符合率達(dá)94.6%，傳統(tǒng)生化Vitek32 ANI鑒定卡45株鑒定結(jié)果與16SrRNA基因序列鑒定結(jié)果一致，符合率為80.4%。與基因鑒定結(jié)果相比較，MALDI-TOF MS技術(shù)鑒定符合率高于傳統(tǒng)生化鑒定技術(shù)。

       3、 MALDI-TOF MS對(duì)真菌的鑒定

       目前，臨床上對(duì)于真菌的鑒定主要有傳統(tǒng)的微生物鑒定法、Vitek微生物鑒定系統(tǒng)及MALDI-TOF MS法。傳統(tǒng)微生物鑒定中對(duì)于真菌一般有壓片、染色鏡檢，觀察其菌絲和孢子，接種沙保羅培養(yǎng)基（固體和液體），咖馬伽顯色培養(yǎng)基，由于真菌生長(zhǎng)周期長(zhǎng)，傳統(tǒng)方法無(wú)法滿足臨床對(duì)于病原菌快速而準(zhǔn)確鑒定的要求。

       有報(bào)道稱，對(duì)于臨床分離得到的241株真菌通過(guò)MALDI-TOF MS進(jìn)行鑒定（包括念珠菌、隱球菌、紅酵母），92%均能準(zhǔn)確鑒定到種的水平。在真菌的鑒定方面許多研究證實(shí)MALDI-TOF MS能夠用來(lái)鑒定多種真菌，尤其是臨床比較常見(jiàn)酵母菌，也能對(duì)青霉、曲霉、鐮刀菌、以及皮膚真菌等進(jìn)行鑒定。

       4、 MALDI-TOF MS對(duì)結(jié)核及非典型分枝桿菌的檢測(cè)

       由于結(jié)核及非典型分枝桿菌的營(yíng)養(yǎng)要求高（必須在含血清、卵黃、馬鈴薯、甘油以及含某些無(wú)機(jī)鹽類的特殊羅氏培養(yǎng)基上才能生長(zhǎng)良好）、生長(zhǎng)緩慢（14～18h分裂1次，在固體培養(yǎng)基上2～5w才出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的菌落），傳統(tǒng)微生物鑒定只能通過(guò)抗酸染色、培養(yǎng)、PCR等對(duì)其進(jìn)行鑒定，不僅費(fèi)時(shí)，而且PCR對(duì)試驗(yàn)條件和人員素質(zhì)要求均較高，成本較大。而MALDI-TOF MS則可以快速而準(zhǔn)確的獲取其特異的蛋白質(zhì)譜圖，通過(guò)與數(shù)據(jù)庫(kù)的比對(duì)快速得出結(jié)果。

       此外，與VITEK-MS系統(tǒng)相比，應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)臨床分離株進(jìn)行鑒別，從基因水平和物種水平兩方面的鑒定率分別為87.3%和62.8%，均優(yōu)于VITEK-MS系統(tǒng)。運(yùn)用16SrRNA進(jìn)行基因測(cè)序無(wú)法區(qū)分膿腫分枝桿菌和龜分枝桿菌，而質(zhì)譜則可以，其鑒定率為57.1%（12/21）。

       5、 MALDI-TOF MS對(duì)病毒的檢測(cè)

       至今為止，應(yīng)用MALDI-TOF MS技術(shù)來(lái)檢測(cè)病毒方面的報(bào)道很少，但有報(bào)道可用MALDI-TOF MS來(lái)鑒定病毒融合蛋白，來(lái)確定病毒株的毒力、病毒糖蛋白、衣殼蛋白。還有報(bào)道用MALDI-TOF MS通過(guò)病毒蛋白不同的分子量從病毒基因組水平來(lái)鑒別特定限制性片段，或者用來(lái)鑒別特異的基因突變。

       6、 MALDI-TOF MS對(duì)細(xì)菌的毒力因子鑒定

       應(yīng)用MALDI-TOF MS對(duì)金黃色葡萄球菌的毒力因子鑒定已有報(bào)道，然而需要先在SDS-PAGE上提取蛋白。近日，Bittar等，成功的使用MALDI-TOF MS鑒定出了PVL（Panton–Valentine leukocidin）陽(yáng)性的葡萄球菌。應(yīng)用ClinProToolsTM軟件（布魯克道爾頓，德國(guó)）分析，在57株P(guān)VL陰性金葡和24株P(guān)VL陽(yáng)性金葡中，PVL陽(yáng)性株能在4448m/z質(zhì)譜峰處檢測(cè)到特異質(zhì)譜峰。應(yīng)用此特異質(zhì)譜峰篩選34株金葡，發(fā)現(xiàn)2株P(guān)VL陽(yáng)性株。此種方法的敏感性、特異性、陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值分別為100%、90.6、40和100%。

       深度應(yīng)用

       1、MALDI-TOF MS對(duì)血培養(yǎng)的直接鑒定

       菌血癥、敗血癥及膿毒血癥等血流感染的感染率逐年增高，發(fā)病急、致死率高使其對(duì)快速微生物鑒定的需求更加緊迫。

       Katherine Bond等研究報(bào)道了應(yīng)用MALDI-TOF MS直接對(duì)血陽(yáng)性瓶進(jìn)行鑒定的應(yīng)用。與傳統(tǒng)培養(yǎng)需要24h或更多時(shí)間的檢測(cè)技術(shù)相比，MALDI-TOF MS可以在4~6小時(shí)內(nèi)對(duì)血液標(biāo)本中的致病菌進(jìn)行檢測(cè)和鑒定。荷蘭的Marc Bonten團(tuán)隊(duì)研究顯示對(duì)血液標(biāo)本中的致病菌進(jìn)行MALDI-TOF MS鑒定的平均時(shí)間是16小時(shí)，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法需要45小時(shí)相比大大縮短了檢測(cè)時(shí)間，也為臨床合理應(yīng)用抗生素治療提供了可靠的依據(jù)。美國(guó)休斯敦的James Musser團(tuán)隊(duì)的研究數(shù)據(jù)顯示應(yīng)用MALDI-TOF MS后，膿毒血癥患者的住院時(shí)間平均縮短了3天。

       Foster AG等從需氧、厭氧和兒童瓶三種血培養(yǎng)瓶中選出253份陽(yáng)性標(biāo)本利用MALDITOF MS進(jìn)行檢測(cè)，分別有92.1%和88.1%被鑒定到屬和種；其中161株革蘭陽(yáng)性菌分別有95.7%和90.1%被鑒定到屬和種；92株革蘭陰性菌分別有84.7%和83.7%被鑒定到屬和種。

       Jamal W等對(duì)160例血培養(yǎng)陽(yáng)性標(biāo)本進(jìn)行傳統(tǒng)方法檢測(cè)和MALDI-TOF MS直接鑒定。Bruker SepsiTyper kitTM（STK）和傳統(tǒng)方法的檢出率分別為114（75.6%）和150（93%），利用STK鑒定中，36例鑒定不準(zhǔn)確或未鑒定出，其中5例分值>2.000，31例分值不可信<>

       有研究報(bào)道顯示，利用MALDI-TOF MS技術(shù)直接鑒定血培養(yǎng)瓶中的真菌， 95.9%（187/195）的白色念珠菌與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法一致，86.5%（128/148）的非白色念珠菌與傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定方法一致，且平均時(shí)間在30分鐘左右。

       2、MALDI-TOF MS對(duì)尿液的直接鑒定

       傳統(tǒng)尿液微生物的檢測(cè)依賴于涂片及細(xì)菌的培養(yǎng)，但臨床更傾向于快速的檢測(cè)技術(shù)，現(xiàn)在常規(guī)使用的技術(shù)并不能滿足臨床的需要。MALDI-TOF MS技術(shù)的優(yōu)勢(shì)可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足。

       Ferreira L等對(duì)尿路感染的尿液標(biāo)本分別進(jìn)行傳統(tǒng)檢測(cè)和MALDI-TOF MS鑒定。260例尿液標(biāo)本被UF-1000i、細(xì)菌培養(yǎng)和MALDI-TOF MS都鑒定為陽(yáng)性；20例標(biāo)本被UF-1000i鑒定為陽(yáng)性，而培養(yǎng)和MALDI-TOFMS都鑒定為陰性。220份標(biāo)本細(xì)菌生長(zhǎng)>105CFU/ml，其中202例（91.8%）鑒定到種，204例（92.7%）鑒定到屬，鑒定率最高的是大腸桿菌173株。173株大腸桿菌中MALDI-TOF MS鑒定出163株（94.2%）。

       有學(xué)者對(duì)收集到的1040份尿液標(biāo)本進(jìn)行了尿細(xì)菌培養(yǎng)及直接質(zhì)譜鑒定，其結(jié)果顯示1040份標(biāo)本中共鑒定出細(xì)菌的標(biāo)本有52 6份，其中包括培養(yǎng)出1種菌的標(biāo)本430份，尿病原菌直接質(zhì)譜鑒定率為92.7%（430/464）；培養(yǎng)出2種菌的標(biāo)本96份，尿病原菌直接質(zhì)譜鑒定率為75%（96/128）；尿病原菌直接質(zhì)譜鑒定法鑒定出的細(xì)菌與尿細(xì)菌培養(yǎng)法鑒定出的細(xì)菌菌種一致，符合率為100/100。王新華等結(jié)合UF-1000i 和MALDI-TOF MS直接對(duì)1456例尿路感染的尿液標(biāo)本進(jìn)行鑒定，鑒定的準(zhǔn)確率為1381（94.8%）。

       3、質(zhì)譜與核酸研究

       現(xiàn)代質(zhì)譜技術(shù)自誕生以來(lái)，在多肽及蛋白質(zhì)的研究中獲得極大的成功，于是人們開(kāi)始嘗試著將質(zhì)譜技術(shù)用于核酸的研究工作。近年來(lái)，合成寡核苷酸及其類似物，作為反義治療劑在病毒感染和一些癌癥的治療方面，有著良好的前景。

       寡核苷酸作為藥物，其結(jié)構(gòu)特征必須進(jìn)行確證。常規(guī)的色譜或電泳技術(shù)只能對(duì)其濃度和純度進(jìn)行分析，而對(duì)其堿基組成、序列等結(jié)構(gòu)信息卻無(wú)能為力。ESI和MALDI質(zhì)譜技術(shù)出現(xiàn)，為寡核苷酸及其類似物的結(jié)構(gòu)及序列分析，提供了強(qiáng)有力的方法。它是將被測(cè)寡核苷酸樣品先用外切酶從3’或5’ 端進(jìn)行部分降解，在不同時(shí)間內(nèi)分別取樣進(jìn)行質(zhì)譜分析，獲得寡核苷酸部分降解的分子離子峰信號(hào)，通過(guò)對(duì)相鄰兩個(gè)碎片分子質(zhì)量進(jìn)行比較，可以計(jì)算出被切割的核苷酸單體分子質(zhì)量，將其與四個(gè)脫氧核苷酸的標(biāo)準(zhǔn)分子量進(jìn)行對(duì)照，就可以讀出寡核苷酸的序列。

       由于MALDI-TOF MS技術(shù)分辨率的問(wèn)題，使得其更適合于堿基數(shù)較少的短鏈核酸的分析。如何獲得高分辨率的DNA質(zhì)譜圖，一時(shí)間成為了研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，由于DNA的化學(xué)結(jié)構(gòu)存在著不同于蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)特征，使得DNA樣品存在某些特殊性：1、其結(jié)構(gòu)中存在著磷酸基團(tuán)，有形成鈉磷化合離子的趨勢(shì)。2、在激光解吸離子化過(guò)程中，它的結(jié)構(gòu)不如蛋白質(zhì)穩(wěn)定，易形成碎片，這導(dǎo)致峰寬和分子離子的強(qiáng)度變?nèi)酰瑥亩沟梅直媛氏陆怠?995年，M. L. Vestal 等把離子延遲引出技術(shù)應(yīng)用于MALDI-TOF MS中來(lái)，不但提高了MALDI-TOF MS的分辨率，而且也開(kāi)創(chuàng)了質(zhì)譜應(yīng)用于DNA研究領(lǐng)域的新局面。國(guó)內(nèi)鄧慧敏等也應(yīng)用MALDI-TOF MS法測(cè)定了混合堿基DNA，獲得了高分辨率的DNA質(zhì)譜圖。

       細(xì)菌或真菌的耐藥性檢測(cè)和耐藥機(jī)制研究

       1、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的檢測(cè)

       MALDI-TOF MS常用于鑒別MRSA和甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌（MSSA）。由染色體DNA介導(dǎo)的固有耐藥性，主要是mec基因編碼的PBP2a的耐藥性，這是最常見(jiàn)的耐藥機(jī)制。MALDI-TOF MS主要通過(guò)檢測(cè)MRSA蛋白表達(dá)的差異，來(lái)實(shí)現(xiàn)耐藥性的檢測(cè)。Edwards-Jones V等研究發(fā)現(xiàn)MRSA與MSSA的MALDI-TOF MS檢測(cè)質(zhì)譜圖存在明顯差異，如MRSA特異性峰m/z位于891，1140，1165，1229和2127 Da，而MSSA特異性峰m/z位于2548 和2647 Da。Du Z等對(duì)76株金黃色葡萄球菌進(jìn)行MALDI-TOF MS耐藥性檢測(cè)，結(jié)果顯示MSSA與MRSA的質(zhì)譜圖的差異集中在2400 Da至2500 Da區(qū)間。Majcherczyk等研究也提出MALDI-TOF MS可以用于金黃色葡萄球菌的甲氧西林耐藥檢測(cè)。2012年，Lu等研究了MALDI-TOF MS鑒別社區(qū)獲得性MRSA與醫(yī)院獲得性MRSA的方法，而且證實(shí)了兩種細(xì)菌之間的差異質(zhì)譜峰（m/z 1774 Da和 1792 Da）是社區(qū)獲得性MRSA特異性表達(dá)的酚可溶性調(diào)控蛋白。本實(shí)驗(yàn)室的研究證明MALDI-TOF MS通過(guò)質(zhì)譜峰值的比對(duì)可區(qū)分MRSA與MSSA。

       2、萬(wàn)古霉素耐藥的腸球菌（VRE）的檢測(cè)

       MALDI-TOF MS用于VRE檢測(cè)的研究并不多，Griffin通過(guò)對(duì)質(zhì)譜峰數(shù)學(xué)建模的方式，能夠?qū)y帶vanB基因的VRE與萬(wàn)古霉素敏感的屎腸球菌鑒別。

       3、革蘭陰性桿菌耐藥性檢測(cè)

       外膜蛋白OmpK36的缺失與AmpC酶聯(lián)合可以導(dǎo)致細(xì)菌對(duì)碳青霉烯類抗生素耐藥。國(guó)內(nèi)研究還將MALDI-TOF MS應(yīng)用于克雷伯菌屬的細(xì)胞外膜蛋白OmpK36的檢測(cè)，在檢測(cè)外膜蛋白方面MS明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的SDS-PAGE方法。

       產(chǎn)ESBLs酶或碳青霉烯酶是革蘭氏陰性桿菌耐藥的最主要原因。MALDI-TOF MS檢測(cè)的原理是β-內(nèi)酰胺類抗生素的β內(nèi)酰鍵被細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺類酶水解，導(dǎo)致抗生素分子量增加18Da?？股氐牧u基會(huì)與鹽溶液中的Na結(jié)合導(dǎo)致分子量增加22Da。某些環(huán)境下，水解產(chǎn)物會(huì)直接脫羧，引起分子量減少44Da。通過(guò)質(zhì)譜監(jiān)測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素分子量的變化，即可準(zhǔn)確鑒定細(xì)菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺類酶。近兩年，國(guó)內(nèi)外研究集中在MALDI-TOF MS腸桿菌的KPC、VIM、IMP、NDM及OXA[30-31]菌株鑒定上。不同研究組所選擇的β-內(nèi)酰胺類抗生素、基質(zhì)、緩沖液、水解時(shí)間、質(zhì)譜儀參數(shù)、質(zhì)譜圖分析等均有所差異，導(dǎo)致質(zhì)譜圖的判斷標(biāo)準(zhǔn)不一致，需要進(jìn)一步優(yōu)化方法，建立標(biāo)準(zhǔn)化的檢測(cè)程序，使研究結(jié)果具有可比性。國(guó)內(nèi)研究將ClinPro Tools軟件與質(zhì)譜的檢測(cè)相結(jié)合，通過(guò)數(shù)學(xué)建模實(shí)現(xiàn)質(zhì)譜圖的自動(dòng)化分析，實(shí)現(xiàn)耐藥細(xì)菌與敏感細(xì)菌的自動(dòng)分組鑒別。

       4、耐藥基因突變的檢測(cè)

       MALDI-TOF MS的微測(cè)序法可以檢測(cè)耐藥基因的單核苷酸多態(tài)性。Ikryannikova等應(yīng)用MALDI-TOF MS微測(cè)序法檢測(cè)了利福平耐藥結(jié)核分枝桿菌的rpoB基因及異煙肼耐藥結(jié)核分枝桿菌katG基因的突變，同時(shí)該研究組還應(yīng)用此技術(shù)檢測(cè)了blaTEM基因突變。

       5、真菌藥物敏感試驗(yàn)的檢測(cè)

       檢測(cè)原理是真菌在不同濃度的抗真菌藥的壓力下，表達(dá)的蛋白組會(huì)不同，MALDI-TOF MS可以檢測(cè)其蛋白譜的變化。Carolis 應(yīng)用MALDI-TOF MS檢測(cè)了酵母菌及曲霉菌的卡泊芬凈的最低抑菌濃度。

      質(zhì)譜目前仍存在的缺陷

       MALDI-TOF MS技術(shù)利用自己獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，在多個(gè)領(lǐng)域都起到了至關(guān)重要的作用，然而，由于技術(shù)的不夠完善及臨床要求的不斷提高，MALDI-TOF MS的缺陷也一一顯現(xiàn)出來(lái)。

       作為一項(xiàng)新技術(shù)，MALDI-TOF MS雖在多個(gè)領(lǐng)域都顯示出它的優(yōu)勢(shì)，然而最初的儀器成本高是我們不得不接受的事實(shí)，這就使一些臨床機(jī)構(gòu)望而卻步。

       由于MALDI-TOF MS技術(shù)的原理是基于不同的蛋白質(zhì)譜圖，所以需要純培養(yǎng)或單個(gè)菌落，這就為難培養(yǎng)病原體提出了新的挑戰(zhàn)，也增加了標(biāo)本的前處理難度。而且MALDI-TOF MS也不能將蛋白表達(dá)相近的細(xì)菌區(qū)分，為臨床對(duì)不同菌種的鑒定提出了挑戰(zhàn)。

       臨床的需求不斷增加，現(xiàn)有的數(shù)據(jù)庫(kù)并不能滿足臨床的需求，對(duì)一些不常見(jiàn)病原體，MALDI-TOF MS缺乏相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，因此我們需要去豐富現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)，增加一些罕見(jiàn)菌的質(zhì)譜圖來(lái)滿足臨床的需要。

       基于MALDI-TOF MS技術(shù)的原理，我們只能對(duì)病原體做到定性，很難做到定量。雖然在抗生素耐藥方面我們已經(jīng)取得了一定的成效，但是對(duì)抗生素耐藥性的檢測(cè)能力有限。而且作為一項(xiàng)新技術(shù)對(duì)于報(bào)告結(jié)果的驗(yàn)證和解釋缺乏統(tǒng)一的實(shí)用性的操作手冊(cè)，因此仍我們要求在以后的科研和工作中不斷去鉆研去完善。