來源：騰訊網(wǎng)        時(shí)間：2021-01-05

         這是《腸道產(chǎn)業(yè)》第 482 篇文章 

        編者按：

       牛津納米孔技術(shù)公司（ONT）的目標(biāo)是 “讓任何人都可以隨時(shí)隨地進(jìn)行基因分析”。實(shí)際上，牛津納米孔技術(shù)公司（ONT）的測(cè)序儀已經(jīng)推廣至 80 個(gè)國家地區(qū)。并且，該技術(shù)支持了 2016 年利比里亞爆發(fā)埃博拉疫情期間的病毒診斷測(cè)試，同時(shí)還可用于建立新人類參考基因組項(xiàng)目。  

       那么未來納米孔測(cè)序技術(shù)將如何繼續(xù)發(fā)展？今天我們特別編譯了發(fā)表在Genetic Engineering & Biotechnology News雜志上關(guān)于納米孔測(cè)序技術(shù)的文章。希望本文能夠?yàn)橄嚓P(guān)的產(chǎn)業(yè)人士和諸位讀者帶來一些啟發(fā)和幫助。 

        瘋狂的想法  

       2014 年 6 月，英國伯明翰大學(xué)微生物學(xué)教授 Nick Loman 博士在 Twitter 上發(fā)布了使用革命性新型測(cè)序儀收集的第一批數(shù)據(jù)。 

       Nick Loman 博士用“波浪圖”形象地展示了，當(dāng) DNA 鏈快速穿過通道時(shí)，電流是如何隨時(shí)間變化的。并且，Loman 博士的課題組將圖中的“峰”和“谷”成功轉(zhuǎn)換為銅綠假單胞菌的 DNA 序列。  

       Loman 是便攜式 DNA 測(cè)序儀 minION 的早期擁護(hù)者。minION 是英國牛津納米孔生物技術(shù)公司（ONT）生產(chǎn)的第一臺(tái)儀器。 

       Loman 發(fā)表的這條 Twitter 距離加利福尼亞大學(xué)圣克魯斯分校生物分子工程學(xué)教授 David Deamer 提出納米孔測(cè)序概念已經(jīng)近 25 年。  

       Deamer 教授回憶稱，在 1989 年 6 月，腦中忽然涌現(xiàn)出靈感——如果 DNA 鏈在一定電壓下通過膜通道會(huì)產(chǎn)生什么現(xiàn)象呢。從此，他就對(duì)開始了對(duì)納米孔測(cè)序的深入探索之旅。  

      當(dāng)時(shí)，哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的基因組科學(xué)家 George Church 博士也在研究類似的課題。幾年后，在 1995 年，Deamer 和 Church 連同哈佛大學(xué)生物學(xué)博士、名譽(yù)教授 Dan Branton 等人，將他們的想法申請(qǐng)了專利。  

       當(dāng)時(shí)哈佛大學(xué)專利局的 Branton 認(rèn)為：“這真是個(gè)瘋狂的主意。它永遠(yuǎn)都行不通的?！?然而，事實(shí)證明，Church 的提議具有足夠的說服力。哈佛大學(xué)批準(zhǔn)并向授予專利的美國專利局提交了申請(qǐng)。 

 圖.1989 年，David Deamer 教授寫下的筆記。 

        實(shí)現(xiàn)愿景  

       2005 年，牛津大學(xué)化學(xué)生物學(xué)教授 Hagan Bayley 博士成立了 Oxford Nanolabs，即 ONT。Gordon Sanghera 博士被聘為創(chuàng)始 CEO。參與公司創(chuàng)立的還有當(dāng)時(shí)在 IP 集團(tuán)工作的 Spike Willcocks 博士，現(xiàn)在是 ONT 的首席 BD。  

       在距 Bayley 實(shí)驗(yàn)室僅幾個(gè)街區(qū)的牛津的一家酒吧喝酒時(shí)，Sanghera 獲得了 IP 集團(tuán)公司的第一筆重大投資——50 萬英鎊。 

       直到 2012 年 2 月，在佛羅里達(dá)州馬可島的 AGBT（Advances in Genome Biology and Technology，基因組生物學(xué)與技術(shù)新進(jìn)展）高端會(huì)議上，ONT 的首席技術(shù)官 Clive Brown 在題為“Single Molecule ‘Strand’ Sequencing Using Protein Nanopores and Scalable Electronic Devices”的演講中介紹了 MinION。 

        “使用蛋白質(zhì)納米孔和可擴(kuò)展電子設(shè)備進(jìn)行測(cè)序?！?Brown 曾在英國 Solexa 下一代測(cè)序（NGS）公司（2007 年被 Illumina 收購）任職。所以他的任務(wù)就是，以某種方式推翻他之前幫助建立的技術(shù)，而這一傳統(tǒng)測(cè)序平臺(tái)已經(jīng)占領(lǐng)了 NGS 市場(chǎng)的很大份額。 

        ONT 的競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手不僅包括 Illumina，而且還包括 Pacific Biosciences 和 MGI 以及剛進(jìn)入測(cè)序領(lǐng)域的初創(chuàng)公司。令人興奮的是，PacBio 公司長而準(zhǔn)確的 HiFi 測(cè)序以及 MGI 帶有 CoolMPS 化學(xué)技術(shù)的新測(cè)序平臺(tái)正在孵化中，后者聲稱可以提供僅需 100 美元的基因組（在今年舉行的 AGBT 高端會(huì)議上宣布，即大流行之前）。  

       自 2012 年以來，ONT 的技術(shù)有了長足的發(fā)展。除了擁有最多 512 個(gè)納米孔通道的袖珍型設(shè)備 MinION 外，ONT 產(chǎn)品陣容還包括更大的 GridION，這是一款緊湊的臺(tái)式設(shè)備，旨在運(yùn)行和分析多達(dá)五個(gè) MinION 流通池（flow cells），以同時(shí)生成多達(dá) 150 Gb 的數(shù)據(jù)。 

        對(duì)于更大的需求和應(yīng)用，ONT 開發(fā)了 PromethION 臺(tái)式系統(tǒng)，是 ONT 最高吞吐量的定序器，具有 48 個(gè)流通池，能夠生成多達(dá) 8 Tb 的數(shù)據(jù)。 

       Flongle 是一種新產(chǎn)品，是 MinION 或 GridION 的適配器，可使這些儀器更快、更便捷的完成一些較小的測(cè)試和實(shí)驗(yàn)。  

      生物信息學(xué)顧問 Albert Vilella 博士表示，ONT 在最近的更新中透露，使用 Flongle 流通池可以以 100 美元完成實(shí)驗(yàn)，這將成為“游戲規(guī)則改變者”，并意味著會(huì)有越來越多的人采納 ONT 技術(shù)。 

       Villela 斷言，屆時(shí)將沒有競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手能夠以這種價(jià)格進(jìn)行技術(shù)部署。 

        ONT 即將推出的 Plongle，本質(zhì)上是一種與 96 孔板兼容的 Flongle，可以并行進(jìn)行大量小型的快速測(cè)試。 

        而仍在開發(fā)中的 SmidgION 將成為 ONT 迄今為止最小的設(shè)備，專為智能手機(jī)或其他低功耗移動(dòng)設(shè)備而設(shè)計(jì)。 

        在 ONT 成立的 15 年后，它遇到了另一個(gè)機(jī)遇，可以讓其充分發(fā)揮其潛力。長期以來，Sanghera 一直表示，ONT 傳感器以快速讀取 DNA 能力方面見長，例如針對(duì)糖尿病患者的針刺試驗(yàn)。COVID-19 大流行恰巧提供了這樣的機(jī)會(huì)。 

圖.牛津納米孔技術(shù)公司的 Gordon Sanghera 博士。 

       從生成序列到診斷 

       在今年 8 月初高調(diào)發(fā)布之后，ONT 決心在 COVID-19 的診斷產(chǎn)生一定的影響力。因?yàn)?COVID-19 是一種流行病，迫使學(xué)術(shù)界科學(xué)家和商業(yè)公司與時(shí)間賽跑，加速創(chuàng)新。ONT 宣布與英國衛(wèi)生與社會(huì)護(hù)理部達(dá)成協(xié)議，推出了 COVID-19 測(cè)試試劑盒 LamPORE。

       LamPORE 主要用于處理拭子和唾液樣品。一臺(tái) MinION 最多可以容納 1500 個(gè)粘貼有條形碼的患者樣品，并在大約 90 分鐘內(nèi)完成運(yùn)行。 

        Sanghera 表示：“LamPORE 具有高效完成檢測(cè)的潛力，此外至關(guān)重要的一點(diǎn)是，其測(cè)試解決方案向全球開放。不僅適用于 COVID-19，而且還適用于多種其他病原體?！? 

       LamPORE 融合了兩個(gè)操作過程，即 LAMP 環(huán)介導(dǎo)的等溫?cái)U(kuò)增和納米孔測(cè)序。LAMP 是一種維護(hù)成本相對(duì)較低的 DNA 擴(kuò)增過程，具有較高的特異性和效率。在恒溫條件下，用單個(gè)試管就能完成，價(jià)格很便宜。  

       LAMP 一開始是由一群日本研究人員在 20 年前開發(fā)出來的。由于其在 COVID-19 診斷方面的適用性，最近 LAMP 技術(shù)再度火爆市場(chǎng)。其他研制 COVID-19 診斷技術(shù)的公司包括 Color、Sherlock Biosciences 和 STOPCovid，也依靠 LAMP 進(jìn)行擴(kuò)增。 

       擴(kuò)增后，LamPORE 使用納米孔測(cè)序來鑒定 SARS-CoV-2 病毒的三個(gè)基因。該方法可以鑒定是真實(shí)存在病毒還是擴(kuò)增過程中發(fā)生的錯(cuò)誤——假陽性結(jié)果的主要來源。此外，該測(cè)試還引入了人類 mRNA 的內(nèi)部對(duì)照，以識(shí)別樣品采集中的錯(cuò)誤（如，無效的咽拭子）——假陰性結(jié)果的主要來源。  

       除了 SARS-CoV-2，ONT 還在繼續(xù)開發(fā) LamPORE，以用于測(cè)試單個(gè)樣本中的多種病原體，包括 A 型流感（H1N1 和 H3N2）、B 型流感和呼吸道合胞病毒。正如資深基因組學(xué)博主Keith Robison 博士所寫的那樣，“呼吸道病毒檢測(cè)的廣泛部署和使用，可能是流行病籠罩中一線微弱的曙光。”  

       LamPORE 之所以能讓人們?nèi)绱伺d奮，很大程度取決于其可擴(kuò)展性，可以快速完成對(duì)抗疫一線工作者和機(jī)場(chǎng)、療養(yǎng)院和學(xué)校等地區(qū)的篩查。LamPORE 的合規(guī)性申請(qǐng)已經(jīng)提交，正在等待批準(zhǔn)。 

圖.牛津納米孔技術(shù)公司的 Clive Brown 

       動(dòng)態(tài)改變序列 

       自適應(yīng)測(cè)序（Adaptive sequencing，一種選擇性測(cè)序）根據(jù)是否存在目標(biāo)序列，在測(cè)序過程中建立一個(gè)決策點(diǎn)。如果存在目標(biāo)序列，則繼續(xù)測(cè)序；相反，電壓反轉(zhuǎn)，彈出 DNA 鏈，釋放出納米孔以允許新鏈進(jìn)入。該決策是通過將 DNA 序列與目標(biāo)參考序列進(jìn)行匹配來確定的。  

       通過借助這項(xiàng)技術(shù)，研究人員無需進(jìn)行前期準(zhǔn)備或富集樣品，即可進(jìn)行選擇性測(cè)序。通過實(shí)時(shí)控制孔電壓，可以全程觀察測(cè)序的動(dòng)態(tài)變化。  

       約翰·霍普金斯大學(xué)計(jì)算機(jī)科學(xué)與生物學(xué)副教授 Michael Schatz 博士表示，在傳統(tǒng)測(cè)序過程中，有很多數(shù)據(jù)可能是冗余的，也可能來自基因組的無關(guān)區(qū)域。Schatz 指出：“自適應(yīng)測(cè)序改變了這一切，因?yàn)樗梢赃x擇性地瞄準(zhǔn)與目標(biāo)相關(guān)的序列。” 

       Schatz 繼續(xù)解釋道，“Killer 應(yīng)用”是針對(duì)靶向測(cè)序開發(fā)的，即研究人員只對(duì)某一組特定的基因感興趣時(shí)。 當(dāng) Schatz 實(shí)驗(yàn)室的研究人員使用自適應(yīng)測(cè)序法靶向 148 個(gè)與遺傳性癌癥相關(guān)的基因時(shí)，他們能夠使用一個(gè)流通池完成基因測(cè)序，而不再需要標(biāo)準(zhǔn)的 5 個(gè)或 6 個(gè)流通池。  

       Schatz 指出，自適應(yīng)測(cè)序在宏基因組學(xué)中有廣泛的用途，可以對(duì)感興趣的基因組進(jìn)行選擇性測(cè)序，并富集低豐度的物質(zhì)。最后，Schatz 指出，他們目前正在努力將自適應(yīng)測(cè)序技術(shù)擴(kuò)展到 cDNA 和 RNA，以實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄本的選擇性測(cè)序。  

       Schatz 說，他可以預(yù)見到未來某一天，“所有的納米孔測(cè)序都將使用自適應(yīng)測(cè)序進(jìn)行 DNA 和 RNA 測(cè)序。” 

        重新定義“長” 

       長讀測(cè)序的一大優(yōu)點(diǎn)（ONT 和 PacBio 的優(yōu)點(diǎn)）是能夠讀懂復(fù)雜的、高度重復(fù)的 DNA 區(qū)域。盡管自人類基因組計(jì)劃完成以來，測(cè)序技術(shù)有了巨大的進(jìn)步，但科學(xué)家們一直無法完成整條染色體從頭到尾的連續(xù)序列的測(cè)序，直到國際端粒到端粒聯(lián)盟（T2T）接手后才獲得完整的染色體基因序列。  

       T2T 是一個(gè)開放項(xiàng)目，用于研究人類基因組的第一個(gè)完整參考序列。T2T 聯(lián)盟由加州大學(xué)圣克魯茲大學(xué)基因組學(xué)研究所助理研究員 Karen Miga 博士和美國國家人類基因組研究所計(jì)算生物學(xué)和基因組信息學(xué)部的 Sergey Koren 博士和 Adam Phillippy 博士領(lǐng)導(dǎo)。 

       去年 7 月，T2T 在《自然》雜志上，報(bào)道了首個(gè)端粒到端粒的無缺口人類 X 染色體圖譜。  

       組裝完整染色體的一個(gè)最困難的一點(diǎn)在于，如何完成重復(fù) DNA 區(qū)域的組裝。為了回答“高覆蓋、超長讀測(cè)序是否能夠解析人類基因組的完整組裝”這一問題，Miga 和同事建立了 T2T 聯(lián)盟。  

       盡管納米孔測(cè)序是生成完整基因組（從葡萄胎 CHM13）的高覆蓋度、超長讀取序列的核心，但是該團(tuán)隊(duì)還借助了多平臺(tái)技術(shù)（包括 PacBio、Illumina 平臺(tái)），同時(shí)融合了多種用于質(zhì)量改進(jìn)和驗(yàn)證的技術(shù)（10x Genomics 的拋光技術(shù)和 BioNano Genomics 的光學(xué)地圖技術(shù)）。  

      該項(xiàng)目是在單倍體基因組上進(jìn)行的，但 Miga 小組將研究重點(diǎn)轉(zhuǎn)向二倍體樣品。Miga 在 2019 年倫敦電話會(huì)議上指出：“過去，我們一直使用的是具有數(shù)百個(gè)缺口的不完整的人類參考基因組?！?T2T 的目標(biāo)就是將基因組學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)移到完整性和質(zhì)量上。  

       Miga 斷言人類正在進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代，“需要完整，高質(zhì)量的染色體組裝體”。如果真是這樣的話，那么 ONT 在下一代測(cè)序中所發(fā)揮的作用將很有趣。