來源：測序中國        時間：2021-11-22

       第三代測序技術是指單分子實時測序技術，也叫從頭測序技術。與前兩代測序技術相比，其最大的特點就是單分子測序，測序過程無需進行PCR擴增，實現(xiàn)了對每一條DNA分子的單獨測序。就當前形勢來看，第二代短讀長測序技術在測序市場上仍然占有絕對優(yōu)勢，但第三代測序技術近年來也發(fā)展的如火如荼，且已應用于基因組測序、甲基化研究和突變鑒定等多個研究領域。其中，英國牛津納米孔公司所開發(fā)的納米孔（Nanopore）測序技術便是三代測序中的中流砥柱。 

        什么是Nanopore測序？ 

圖片來源：Oxford Nanopore Technologies官網(wǎng) 

       Nanopore測序原理：納米孔測序，顧名思義，核心就是利用一個納米孔，孔內(nèi)共價結合有分子接頭，將納米孔蛋白固定在電阻膜上后，再利用動力蛋白牽引核酸穿過納米孔。當核酸通過納米孔時使電荷發(fā)生變化，從而引起電阻膜上電流的變化。由于納米孔的直徑非常細小，僅允許單個核酸聚合物通過，而ATCG單個堿基的帶電性質(zhì)不一樣，因此不同堿基通過蛋白納米孔時對電流產(chǎn)生的干擾不同，通過實時監(jiān)測并解碼這些電流信號便可確定堿基序列，從而實現(xiàn)測序。 

        Nanopore測序中發(fā)揮著重要作用的幾種物質(zhì)： 

 圖片來源:Oxford Nanopore Technologies官網(wǎng) 

       Reader——跨膜蛋白，可以嵌入到細胞膜中作為離子或分子通道的跨膜蛋白，具有天然的蛋白納米孔。經(jīng)過人為基因工程修飾后，得到Nanopore測序所需的Reader蛋白。 

        Membrane——多聚物薄膜，Reader蛋白會被嵌入到高電阻率的由人工合成的多聚物膜中，膜兩側是離子溶液，在兩側加不同的電位，離子就會在孔中流動，形成電流。 

       Motor——馬達蛋白，在Nanopore文庫構建時，需要在接頭上連接一種馬達蛋白，用于將DNA或RNA分子推入納米孔中。 

       Tether——用于錨定DNA或RNA鏈，防止其在溶液中飄動，并使其進入納米孔中。 

       Nanopore測序的具體流程如何？ 

       Nanopore測序過程：解螺旋，將雙鏈DNA解開成單鏈；DNA單鏈分子通過一個孔道蛋白，孔道中有個充當轉換器的蛋白分子；DNA單分子停留在孔道中，有一些離子通過帶來電流變化，而不同的堿基帶來的電流變化不同；轉化器蛋白分子感受5個堿基的電流變化；根據(jù)電流變化的頻譜，應用模式識別算法得到堿基序列。 

       Nanopore測序技術的優(yōu)勢在哪？ 

       主要優(yōu)勢： 

       長讀長：Reads可達Mb； 

       設備成本低：測序芯片可清洗再生，重復利用； 

       實時獲得序列信息：最快可在1小時內(nèi)完成測序流程及數(shù)據(jù)分析，滿足動態(tài)檢測宏基因組需求； 

       便攜式測序裝置：重量輕且占用空間小，可以隨身攜帶隨時測序； 

       直接測序：直接測序原始DNA和RNA，不需要進行PCR擴增，避免了擴增偏好性；保留了原始堿基修飾信息，能夠直接讀出甲基化的胞嘧啶。 

        Nanopore測序技術的應用前景如何？ 

       應用方向： 

       #1 大基因組拼接   

        在以往基于短片段的基因組拼接中，由于一些動植物基因組本身具有多倍體，高度重復，高度雜合的特性，導致基因組拼接異常艱難。而Nanopore測序技術具有長讀長的特點，利于大基因組的拼接，可以極大的提高基因組的完整性。 

       #2 全長轉錄組    

       以往的轉錄組分析由于無法直接對RNA進行測序，往往需要先對mRNA進行打斷，再反轉錄為cDNA，無法獲取和分析全長轉錄本。Nanopore的長讀長特點可以準確識別各基因的多個同源異構體，簡單準確；并且可以直接測序RNA，直接識別RNA的堿基修飾。 

       #3 大片段結構變異

      基因組上會產(chǎn)生很多與人類疾病相關的大片段結構變異（如缺失、倒位和易位等），短測序讀長無法準確檢測這些變異，而Nanopore測序的讀長較長，適合進行大片段結構變異的檢測，在疾病研究等方面具有良好的發(fā)展前景。 

 #4 微生物快速鑒定

      由于Nanopore測序具有實時，快速的特點，可以在采集點直接進行測序，實時得到序列信息進行物種分類鑒定，完成微生物的快速鑒定。

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